1853年、肥後国（現在の熊本県）の庄屋の家に生まれました。幼い頃は武術に熱中し、軍人や政治家になることを夢見ていましたが、熊本医学校でオランダ人医師マンスフェルトと出会い、彼から「お前は医学に向いている」と強く勧められて医学の道を志すようになりました。
東京医学校（のちの東京帝国大学）に進学しますが、「医者の真の使命は病気を治すことではなく、病気を未然に防ぐこと（予防医学）だ！」と強く主張し、既存の治療を重視する教授陣としばしば激しく対立しました。この「予防」への強い信念が生涯の軸となります。
内務省に入省後、その優秀さを買われてドイツへ国費留学します。そこで「近代細菌学の開祖」と呼ばれる偉大なロベルト・コッホに師事。コッホは柴三郎の並外れた集中力と実験技術の高さに驚嘆し、彼を一番弟子として厚く遇しました。
1889年、歴史的偉業を成し遂げます！破傷風菌は空気に触れると死んでしまう「嫌気性菌」であったため、当時の世界中の学者が純粋培養を諦めていました。しかし柴三郎は、水素を使って空気を遮断する特殊な装置を自作し、見事に世界初の純粋培養に成功したのです！
さらに翌年、破傷風の毒素を少しずつ動物に注射して免疫（抗体）を作らせ、その血液の成分（血清）を使って感染者の治療を行う画期的な「血清療法」を同僚のベーリングと共に開発！不治の病だったジフテリアなどにも応用され、何百万もの命を救う道を開きました。
世界的な名声を得て帰国しますが、東大医学部と対立していたため、彼には日本で研究する場所（ポスト）が全く与えられませんでした。この窮地を見かねて「こんな世界的学者を放っておくのは日本の恥だ！」と私財を投じて研究所（伝染病研究所）を建ててくれたのが、福澤諭吉です。
1894年、致死率が非常に高く恐れられていた「ペスト（黒死病）」が香港で大流行すると、日本政府の要請で決死の現地調査へ向かいます。不眠不休で解剖や顕微鏡観察を続け、ついにペストの病原体である「ペスト菌」を発見するという世界的な大発見を成し遂げました！
1914年、政府が彼の「伝染病研究所」を、因縁の相手である東京帝国大学に突然移管すると決定。柴三郎は「事前の相談がない！」と激怒し、所長を辞任。志賀潔ら所員たちも全員一斉に辞表を叩きつけ、自ら資金を集めて私立の「北里研究所」を立ち上げました。
1917年、恩人である福澤諭吉の遺志を継ぎ、慶應義塾大学に医学部が創設されることになると、初代医学部長への就任を快諾します。「福澤先生には大変な恩があるから」と、なんと生涯にわたって無給（タダ）で学部長を務め上げ、後進の育成に全力を注ぎました。
野口英世や志賀潔など、のちの日本を背負う多くの優秀な弟子を育て上げ、「ドン（雷おやじ）」と恐れられながらも深く愛されました。日本の近代医学の礎を築いたその多大な功績が讃えられ、2024年（令和6年）7月から新しい千円札の肖像画として採用されています。
